Выявление антител, ассоциированных с антифосфолипидным синдромом, у больных сифилисом

Резюме. В связи с недостатком сведений об антителах, ассоциированных с антифосфолипидным синдромом при сифилисе, предпринято изучение закономерностей продукции антител при сифилитической инфекции. Уровень антифосфолипидных антител был измерен у 394 больных с различными формами сифилиса, из которых 85 человек находились под динамическим наблюдением. Включенные в исследование пациенты имели полноценные анамнестические данные, соответствовавшие всем необходимым диагностическим критериям, и прошли все виды клинико-лабораторного обследования для установления диагноза. Для выявления использовали наборы ThromboCombo IgG/IgM ELISA Kit, Anti-Cardiolipin Screen, Anti-Cardiolipin ELISA (IgAGM), Anti-β2-Glycoprotein 1 ELISA (IgAMG). Пороговые значения для положительных результатов были определены на основе рекомендаций производителя. Сравнения качественных признаков проводились с помощью критериев Хи-квадрат (χ2) или Фишера, количественных – t-критерия или U-критерия Манна – Уитни, с корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Бонферрони. Для сравнения количественных признаков в связанных выборках использовали парный t-критерий или критерий Уилкоксона. Для оценки связи применяли метод ранговой корреляции Спирмена. Антитела к кардиолипину встречались с наибольшей частотой у больных вторичным сифилисом (81%), причем их частота была значительно выше при первичном (49%) и раннем скрытом (52%) сифилисе по сравнению с поздним скрытым сифилисом (18%), нейросифилисом (15%) и состоянием серорезистентности (17%). Уровень антител к кардиолипину снижался у больных ранним сифилисом вскоре после начала лечения и сохранялся годами на низких значениях без изменений у больных поздним сифилисом. Доля пациентов с положительным тестом на антитела к бета-2-гликопротеину 1 существенно не отличалась при всех формах сифилиса (13-21%). У больных сифилисом не было выявлено значимого иммунного ответа на фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту. Антитела к кардиолипину могут играть роль в развитии осложнений на ранних стадиях сифилиса и быть полезными для ранней диагностики сифилиса и реинфекции, а также для дифференциальной диагностики ранних и поздних форм. Скрининг на сифилис рекомендуется лицам с первым эпизодом повышения уровня антител к кардиолипину.

История открытия антифосфолипидного синдрома (АФС) тесно связана с понятием биологической ложноположительной реакции на сифилис, когда при проведении массового скрининга с помощью реакции Вассермана в первой половине ХХ века обнаружилось, что некоторые неинфицированные люди могут иметь положительный результат теста. Изучение данного феномена и установление кардиолипина в качестве ключевого антигена реакции дало толчок к развитию лабораторных технологий, выявлению ассоциаций с тромботическими нарушениями и формированию понятия АФС. В настоящее время идентифицировано уже целое семейство антител против негативно заряженных фосфолипидов и их кофакторов (фосфолипидсвязывающих протеинов), ассоциированных с нарушениями гемостаза [1]. Для основных антител, включенных в критерии АФС, − антикардиолипиновых антител (а-КЛ) и антител к бета-2-гликопротеину 1 (а-β2ГПI) − производятся коммерческие тест-системы, широко используемые в рутинной диагностике. Наличие хотя бы одного критериального серологического маркера является обязательным условием установления диагноза АФС.

Несмотря на то, что сифилис был первой инфекцией, при которой были выявлены а-КЛ, полноценная научная информация о продукции в ходе инфекционного процесса антител, ассоциированных с АФС, отсутствует. Опубликованы лишь отдельные исследования, в основном с небольшим объемом выборок, без сведений о стадии и клинической форме заболевания обследованных пациентов, с использованием in-house тест-систем [2-8]. Кроме того, недостаточно освещены взаимоотношения между а-КЛ и а-β2ГП1, являющиеся основой принятого деления на «инфекционные», менее значимые антитела, распознающие фосфолипидные антигены, и патогенные «аутоиммунные» антитела, мишенью которых является только комплексный антиген, состоящий из фосфолипида и несущего его белка (β2ГП1) [9]. Также мало исследована возможность синтеза других видов антифосфолипидных антител. Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей продукции антител, ассоциированных с АФС при сифилитической инфекции.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены 394 пациента, получавшие терапию по поводу сифилиса в Уральском НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии (Екатеринбург) в 2008-2022 г., из которых 85 человек находились под динамическим наблюдением. Включенные в исследование пациенты имели полноценные анамнестические данные, соответствовавшие всем необходимым диагностическим критериям, и прошли все виды клинико-лабораторного обследования для установления диагноза.

Кровь забиралась в соответствии со стандартным режимом. После выполнения тестов, утвержденных приказами Министерства здравоохранения РФ для диагностики сифилиса, остатки биологических образцов аликвотировались и хранились при температуре — 80 °С. После завершения процесса набора образцы были подвергнуты исследованию.

Для исследования содержания в крови антифосфолипидных антител были использованы наборы «ThromboCombo IgG/IgM ELISA Kit» и «Anti-Cardiolipin Screen» производства Orgentec Diagnostika GmbH, «Anti-Cardiolipin ELISA (IgAGM)» и «Anti-β2-Glycoprotein 1 ELISA (IgAMG)» производства Euroimmun AG. В качестве верхней границы референтного интервала использовались значения, указанные производителем.

Сравнения качественных признаков проводились с помощью критериев Хи-квадрат (χ²) или Фишера, количественных – t-критерия или U-критерия Манна – Уитни, с корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Бонферрони. Для сравнения количественных признаков в связанных выборках использовали парный t-критерий или критерий Уилкоксона. Для оценки связи применяли метод ранговой корреляции Спирмена. Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05. Нулевая гипотеза (отсутствие различий) отвергалась, если вероятность (p) не превышала ошибку первого рода.

Результаты

У 15 пациентов с первичным (1) и вторичным (7) сифилисом, а также ранним скрытым (2) и поздним скрытым (2) сифилисом, ранним (1) и поздним (1) нейросифилисом, серорезистентностью (1) была исследована концентрация антител классов M и G к четырем фосфолипидам – кардиолипину, фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу и фосфатидиловой кислоте (рис. 1).

Диагностически значимый уровень IgM ко всем четырем фосфолипидам был выявлен только у одной пациентки с клиническими проявлениями вторичного сифилиса в виде алопеции. В целом наблюдалось достоверно более высокое содержание а-КЛ по сравнению с остальными антителами (p < 0,008).

Также у этих же пациентов изучалось изменение степени связывания антител с комплексным фосфолипидным антигеном в зависимости от наличия/отсутствия кофактора β2ГП1. Между полученными значениями выявлена сильная (р < 0,000) прямая корреляция (рис. 2). А в 5 (20%) случаях наблюдалось значимое (свыше 30%) усиление связывания в присутствии β2ГП1, что свидетельствует о наличии пула патогенных «аутоиммунных» антител.

Была определена частота выявления положительных результатов тестов на а-КЛ и а-β2ГП1 при разных формах сифилитической инфекции (рис. 3).

В целом при всех формах сифилиса удельный вес позитивации тестов достоверно превышал таковой, полученный производителями тест-систем при обследовании здоровых доноров (1,5-4%). Ранние формы сифилиса отличались значительно более высокой долей повышенных значений а-КЛ, особенно вторичный сифилис, при котором большинство пациентов имели а-КЛ-положительные пробы. Тогда как положительные результаты теста на а-β2ГП1 встречались одинаково часто при ранних и поздних формах. Анализ комбинаций данных тестов также выявил некоторые особенности (рис. 4). Хотя доля лиц, имеющих хотя бы один из маркеров, не отличалась при ранних и поздних формах, ранним формам был более свойственен моновариант а-КЛ, тогда как поздним − моновариант а-β2ГП1.

При динамическом наблюдении уровня а-КЛ (рис. 5) у больных ранними формами уже к окончанию курса терапии у 43/49 (88%) выявлялось его выраженное снижение, при этом в 8/49 (16%) случаев снизились значения, исходно расцениваемые как нормальные. Среди прошедших контроль в отдаленные сроки наблюдалась почти полная нормализация показателей, тогда как у больных поздними формами в течение многих лет отмечались стабильно низкие значения.

Обсуждение

Ранее проведенные исследования подтвердили участие В1-клеток в иммунном ответе при сифилитической инфекции с преимущественным синтезом антител фосфолипидной специфичности [10]. В данной работе мы уточнили возможность синтеза антител к другим (помимо кардиолипина) представителям отрицательно заряженных фосфолипидов − фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу и фосфатидиловой кислоте. Получены данные, свидетельствующие о том, что данные вещества не являются мишенью для антител при сифилисе, в отличие от другого спирохетоза – лайм-боррелиоза, для которого характерен другой спектр распознаваемых фосфолипидов (фосфатидилсерин и фосфатидиловая кислота, но не кардиолипин) [11]. Таким образом, кардиолипин сохраняет свою позицию основного иммуногенного фосфолипида при сифилисе.

В нашей работе мы установили частоту выявления диагностически значимых уровней антител к кардиолипину при разных формах сифилиса. Наиболее выраженная продукция а-КЛ наблюдалась на ранних стадиях, достигая максимума в период активной диссеминации возбудителя во вторичном периоде и быстро прекращаясь под воздействием специфической терапии. При этом поздние формы, независимо от наличия осложнений (в виде нейросифилиса) или специфической терапии в анамнезе (состояние серорезистентности), демонстрировали одинаковую невысокую частоту положительных результатов а-КЛ и отсутствие динамики в процессе терапии. Возможно, именно гетерогенность соотношения ранних и поздних форм среди обследованных больных сифилисом и обусловила большой разброс опубликованных данных относительно частоты выявления антител к кардиолипину (4-64%) [3-7].

На частоту выявления антител к β2ГП1 форма сифилиса никак не влияла, отличаясь относительным постоянством у разных категориий пациентов. Данные предыдущих исследований также не проявляли значительной вариативности (1-10%) [2, 4, 6, 8]. Возможно, такой уровень демонстрирует популяционную частоту предрасположенности к формированию данного типа антител.

Также проведенное исследование выявило, что а-КЛ при сифилисе в целом соответствуют классическому пониманию «инфекционных» антител [12]. Они демонстрировали невысокие концентрации и достаточно слабую взаимосвязь с кофактором β2ГП1, но в то же время у заметной части пациентов присутствовали а-КЛ с «аутоиммунным» потенциалом.

Хотя возможность триггерной роли инфекций в развитии АФС или АФС-подобных состояний показана для большого числа вирусных, бактериальных, грибковых и протозойных инфекций, в том числе и для сифилиса [13, 14], классические проявления АФС в виде тромбозов крупных сосудов (артерий и вен), тромбоцитопении, привычного невынашивания беременности [2] встречаются достаточно редко, что и послужило основанием для заключения о невысокой патогенности «инфекционных» антител.

В то же время показано, что высокие концентрации антител и их выраженные «аутоиммунные» свойства являются необходимыми факторами развития тромбозов крупных сосудов, тогда как для развития патологии беременности достаточно небольших концентраций а-КЛ в отсутствие значимых количеств β2ГП1 [15]

В последнее время концепция АФС видоизменяется и продемонстрированы такие патологические проявления АФС, как поражение микрососудов либо по типу микротромбозов (при изначально неповрежденной сосудистой стенке), либо по типу микроангиопатии (эндотелиальная пролиферация) [16]. Биологические особенности Treponema pallidum обусловливают ее тропность к эндотелию сосудов с сопутствующими повреждениями и синтез а-КЛ, связанный как с реакцией на фосфолипиды самого возбудителя (в меньшей степени), так и на собственные, являющиеся следствием наносимого повреждения [17], что может быть одним из совокупности факторов, приводящих к развитию осложнений на ранних стадиях инфекции. Поэтому, хотя антифосфолипидные антитела при сифилисе относятся к разряду «инфекционных», это не отрицает однозначно возможность их патогенной роли.

Использующиеся в настоящее время коммерческие наборы для обнаружения а-КЛ не позволяют отличить «инфекционные» антитела от «аутоиммунных» [5], поэтому при диагностике АФС предписано обязательно повторять исследование не менее чем через 12 недель для подтверждения персистирующего характера антител [18]. Однако, учитывая ассоциацию а-КЛ с заразными формами сифилиса и высокую медицинскую и социальную значимость данной инфекции, можно рекомендовать проводить скрининг на сифилис у пациентов с впервые выявленными положительными тестами на а-КЛ. При выборе метода диагностики сифилиса следует принимать во внимание возможность получения ложных результатов из-за повышенного содержания антител к фосфолипидам, которые могут неспецифически реагировать с компонентами антигена. Трепонемные тесты на основе рекомбинантных антигенов предпочтительнее в таких случаях.

Другим следствием выявленных особенностей является потенциальная возможность создания на основе кардиолипина более совершенного диагностикума. Более раннее распознавание инфекции, реинфекции, дифференциальная диагностика ранних и поздних форм сифилиса являются востребованными задачами диагностики сифилиса.

Наше исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, полученная на достаточно большом количестве материала информация о частоте выявления а-КЛ и а-β2ГП1 у больных разными формами сифилиса может не совсем соответствовать в случае использования других тест-систем, так как в связи с отсутствием универсальных стандартов нельзя исключать вариабельность результатов [19]. Во-вторых, в нашем исследовании участвовало достаточно мало пациентов с осложнениями ранних стадий инфекции, что не позволило выявить возможные патологические ассоциации. Однако данные ограничения не оказали значимого влияния на полученные выводы.

Выводы

1. Учитывая, что у больных ранними (заразными) формами сифилиса наблюдается значительная продукция антител, дающих положительные результаты в тестах, используемых для диагностики АФС, необходимо рекомендовать проведение скринингового обследования на сифилис уже при первом выявлении повышенного содержания антител к кардиолипину. В связи с тем, что высокое содержание антител к фосфолипидам может провоцировать ложноположительные результаты при применении цельноклеточных или лизатных антигенов, у таких пациентов для диагностики сифилиса целесообразно использовать тест-системы с рекомбинантными/пептидными антигенами (иммуноферментный анализ и некоторые виды реакции пассивной гемагглютинации).
2. Антигены на основе кардиолипина являются перспективными для разработки диагностикумов с улучшенной способностью дифференцировать ранние и поздние формы сифилиса и диагностировать самые ранние его стадии и реинфекцию.
3. Особенности антифосфолипидных антител при сифилитической инфекции (невысокая концентрация, невыраженная связь с кофактором β2ГП1, преимущественный синтез на начальных стадиях инфицирования) не позволяют исключить их патогенетическую роль в формировании осложнений при ранних формах сифилиса, таких как патология беременности, неврологические, когнитивные и психотические расстройства при отсутствии цереброваскулярных инцидентов и другие. Необходимы дальнейшие исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

CONFLICT OF INTERESTS. Not declared.

Литература/References

1. Bradacova P., Slavik L., Ulehlova J., et al. Current Promising Biomarkers and Methods in the Diagnostics of Antiphospholipid Syndrome: A Review // Biomedicines. 2021; 8; 9 (2): 166.
2. Shen X., Liu D., Lin Y., et al. The characteristics of beta 2-glycoprotein I-dependent anticardiolipin antibody and blood coagulation status in subjects with classical biological false-positive syphilis reactions // I. immunopharmacology. 2018; 62: 132-138.
3. Bernard C., de Moerloose P., Tremblet C., et al. Biological true and false serological tests for syphilis: Their relationship with anticardiolipin antibodies // Dermatologica. 1990; 180: 151-153.
4. Loizou S., Singh S., Wypkema E., et al. Anticardiolipin, anti-beta(2)-glycoprotein I and antiprothrombin antibodies in black South African patients with infectious disease // Ann Rheum Dis. 2003; 62 (11): 1106-1111.
5. McNally T., Purdy G., Mackie I. J., et al.: The use of an anti-b2- glycoprotein-I assay for discrimination between anticardiolipin antibodies associated with infection and increased risk of thrombosis // Br J Haematol. 1995; 91: 471-473.
6. Santiago M., Martinelli R., Ko A., et al. Anti- 2 glycoprotein I and anticardiolipin antibodies in leptospirosis, syphilis and Kala-azar // Clin Exp Rheumatol. 2001; 19: 425-430.
7. Santiago M., Stellin R., Gaburo Júnior N., et al. Antiphospholipid antibodies in syphilis // Braz J Med Biol Res. 1990; 23 (5): 397-402.
8. De Larranaga G. F., Forastiero R. R., Carreras L. O., et al. Different types of antiphospholipid antibodies in AIDS: a comparison with syphilis and the antiphospholipid syndrome // Thromb Res. 1999; 96: 19-25.
9. Levy R. A., de Meis E., Pierangeli S. An adapted ELISA method for differentiating pathogenic from nonpathogenic aPL by a beta 2 glycoprotein I dependency anticardiolipin assay // Thromb. Res. 2004; 114: 573-577.
10. Левчик Н. К., Зильберберг Н. В., Пономарева М. В., Белых О. А. Сифилитическая инфекция: исследование врожденных гуморальных факторов иммунного ответа // Лечащий Врач. 2022; 4 (25): 33-37. [Levchik N. K., Zilberberg N. V., Ponomareva M. V., Belykh O. A. Syphilitic infection: a study on the factors of the innate humoral immune response // Lechaschi Vrach. 2022; 4 (25): 33-37.]
11. Gwynne P. J., Clendenen L. H., Turk S. P., et al. Antiphospholipid autoantibodies in Lyme disease arise after scavenging of host phospholipids by Borrelia burgdorferi // J Clin Invest. 2022; 132 (6): e152506.
12. Matsuura E., Igarashi Y., Fujimoto M., et al. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease // Lancet. 1990; 336: 177-178.
13. Abdel-Wahab N., Lopez-Olivo M. A., Pinto-Patarroyo G. P., Suarez-Almazor M. E. Systematic review of case reports of antiphospholipid syndrome following infection // Lupus. 2016; 25 (14): 1520-1531.
14. Noakes D., Evans K., Pathansali R. The return of a former foe: syphilis with antiphospholipid syndrome as a cause of acute stroke // JRSM Open. 2017; 8 (9): 2054270417725498.
15. Ruffatti A., Olivieri S., Tonello M., et al. Influence of different IgG anticardiolipin antibody cut-off values on antiphospholipid syndrome classification // J Thromb Haemost. 2008; 6: 1693-1696.
16. Praprotnik S., Ferluga D., Vizjak A., et al. Microthrombotic/microangiopathic manifestations of the antiphospholipid syndrome // Clin Rev Allergy Immunol. 2009; 36 (2-3): 109-125.
17. Gao K., Shen X., Lin Y., et al. Origin of Nontreponemal Antibodies During Treponema pallidum Infection: Evidence From a Rabbit Model // J Infect Dis. 2018; 218 (5): 835-843.
18. Решетняк Т. М. Антифосфолипидный синдром: диагностика и клинические проявления (лекция) // Научно-практическая ревматология. 2014; 52 (1): 56-71. [Reshetnyak T. M. Antiphospholipid syndrome: diagnosis and clinical manifestations (a lecture) // Rheumatology Science and Practice. 2014; 52 (1): 56-71.]
19. Vandevelde A., Devreese K. M. J. Laboratory Diagnosis of Antiphospholipid Syndrome: Insights and Hindrances // J Clin Med. 2022; 11 (8): 2164.

Н. К. Левчик, ORCID: 0000-0003-3856-957X, nklevchik@gmail.com
Н. В. Зильберберг, ORCID: 0000-0002-7407-7575, zilberberg@mail.ru
М. В. Пономарева, ORCID: 0000-0003-0409-9856, marpo08@mail.ru

Государственное бюджетное учреждение Свердловской области Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии; 620076, Россия, Екатеринбург, ул. Щербакова, 8

Сведения об авторах:

Левчик Надежда Константиновна, к.м.н., доцент, заведующая научным клиническим отделом сифилидологии и инфекций, передающихся половым путем, Государственного бюджетного учреждения Свердловской области Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии; 620076, Россия, Екатеринбург, ул. Щербакова, 8; nklevchik@gmail.com

Зильберберг Наталья Владимировна, д.м.н., профессор, заместитель директора по научной работе Государственного бюджетного учреждения Свердловской области Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии; 620076, Россия, Екатеринбург, ул. Щербакова, 8; zilberberg@mail.ru

Пономарева Марина Владиславовна, к.б.н., старший научный сотрудник научного экспериментально-лабораторного отдела Государственного бюджетного учреждения Свердловской области Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии; 620076, Россия, Екатеринбург, ул. Щербакова, 8; marpo08@mail.ru

Information about the authors:

Nadezhda K. Levchik, MD, Associate professor, Head of the Clinical department of syphilidology and sexually transmitted infections at the State Budgetary Institution of the Sverdlovsk Region Ural Research Institute of Dermatology, Venereology and Immunopathology; 8 Shcherbakova str., Yekaterinburg, 620076, Russia; nklevchik@gmail.com

Nataliya V. Zilberberg, Dr. of Sci. (Med.), Professor, Deputy Director of the State Budgetary Institution of the Sverdlovsk Region Ural Research Institute of Dermatology, Venereology and Immunopathology; 8 Shcherbakova str., Yekaterinburg, 620076, Russia; zilberberg@mai.ru

Marina V. Ponomareva, Cand. of Sci. (Biol.), Senior researcher at the Department of laboratory medicine at the State Budgetary Institution of the Sverdlovsk Region Ural Research Institute of Dermatology, Venereology and Immunopathology; 8 Shcherbakova str., Yekaterinburg, 620076, Russia; marpo08@mail.ru

Выявление антител, ассоциированных с антифосфолипидным синдромом, у больных сифилисом/ Н. К. Левчик, Н. В. Зильберберг, М. В. Пономарева
Для цитирования: Левчик Н. К., Зильберберг Н. В., Пономарева М. В. Выявление антител, ассоциированных с антифосфоли¬пидным синдромом, у больных сифилисом // Лечащий Врач. 2023; 2 (26): 86-91. DOI: 10.51793/OS.2023.26.2.013
Теги: антифосфолипидный синдром, сифилис, инфекция, антитела